农用微生物菌剂国家标准doc

点击次数:   更新时间:2020-12-19 03:39     来源:1号庄

  微生物肥料术语(NY/T 1113-2006) 1范围 本标准规定了微生物肥料产品类型、菌种、培养基、灭菌、生产和质量检验等方面的主要术语。 本标准适用于微生物肥料生产、质检、应用、科研和教学等领域。 2产品类型 2.1?微生物肥料 ?microbial fertilizer; biofertilizer 含有特定微生物活体的制品,应用于农业生产,通过其中所含微生物的生命活动,增加植物养分的供应量或促进植物生长,提高产量,改善农产品品质及农业生态环境。 注:目前,微生物肥料包括微生物接种剂(2.2)、复合微生物肥料(2.3)和生物有机肥(2.4)。 2.2?微生物接种剂? microbial inoculant [微生物]菌剂 一种或一种以上的目的微生物经工业化生产增殖后直接使用,或经浓缩(6.10)或经载体(6.9)吸附(6.11)而制成的活菌制品。 2.2.1? 单一菌剂? single species inoculant 由一种微生物菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.2? ??? 复合菌剂? multiple species inoculant 由两种或两种以上且互不拮抗的微生物菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.3? 细菌菌剂? bacterial inoculant 以细菌为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.4? 放线菌菌剂? actinomycetic inoculant 以放线菌为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.5 真菌菌剂? fungal inoculant 以真菌为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.6? 固氮菌菌剂? azotobacteria inoculant 以自生固氮菌和/或联合固氮菌为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.7? 根瘤菌菌剂? rhizobia inoculant 以根瘤菌(3.12.2)为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.8? 硅酸盐细菌菌剂? silicate bacteria inoculant 以硅酸盐细菌(3.12.3)为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.9? 溶磷微生物菌剂? inoculant of phosphate-solubilizing microorganism 以溶磷微生物(3.12.4)为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.10? 光合细菌菌剂? inoculant of photosynthetic bacteria 以光合细菌(3.12.5)为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.11? 菌根菌剂? mycorrhizal fungi inoculant 以菌根线)为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.12? 促生菌剂? inoculant of plant growth-promoting rhizosphere microorganism 以植物促生根圈微生物(3.12.8)为生产菌种制成的微生物接种剂(2.2)。 2.2.13? 有机物料腐熟菌剂? organic matter-decomposing inoculant 能加速各种有机物料(包括作物秸秆、畜禽粪便、生活垃圾及城市污泥等)分解、腐熟的微生物接种剂(2.2)。 注:改写NY 609-2002,术语和定义3 2.2.14? 生物修复菌剂? bioremediating inoculant 能通过微生物的生长代谢活动,使环境中的有害物质浓度减少、毒性降低或无害化的微生物接种剂(2.2)。 2.3? 复合微生物肥料 compound microbial fertilizer??? 目的微生物经工业化生产增殖后与营养物质复合而成的活菌制品。 注:改写NY/T 798—2004,术语和定义3 2.4? 生物有机肥? microbial organic fertilizer 目的微生物经工业化生产增殖后与主要以动植物残体(如畜禽粪便、农作物秸秆等)为来源并经无害化处理的有机物料复合而成的活菌制品。 注:改写NY 884—2004,术语和定义3 3菌种 3.1?种? species 在微生物学中,由表型特征极其相似、具有稳定的遗传性状菌株组成,并与其它类群的菌株存在明显差异。 3.2?菌株strain 属于同一个种,但来源不同的单细胞或纯培养的后代。 3.3?? 菌落? colony 微生物在固体基质上生长繁殖形成的肉眼可见的、具有一定形态特征的细胞聚集体。 3.4?菌苔? lawn 大量微生物细胞密集地生长在固体培养基表面而形成的相互联接成片的培养物(6.5)。 3.5?分离? isolation 将微生物个体从含有微生物的样品中分离出来的技术。 3.6?纯化? purification 从混杂的微生物群体中,分离获得同一种微生物个体的技术。 3.7?筛选? screening 从微生物的群体中,采取相关的技术,选择出目的菌株的过程。 3.8?鉴定? identification 对未知微生物菌株进行性状观察和测定,根据规范的参数或检索系统,用对比分析的方法确定该微生物分类地位的过程。 3.9?退化? degeneration 菌株的特定性状逐代减退或消失的现象。 3.10?复壮? rejuvenation 针对菌种退化(3.9)而进行的恢复其原性状的过程。 3.11?保藏? preservation of microorganism 使菌种保持其活力、固有的遗传和生理生化特性,以及形态特征的微生物学技术。 3.12?生产菌种 3.12.1?固氮菌? azotobacteria;nitrogen fixing bacteria 具有生物固氮功能的各种细菌的通称。 3.12.2?根瘤菌? rhizobia 能与豆科植物共生,形成根瘤,并进行生物固氮的一类革兰氏阴性杆菌。 3.12.3?硅酸盐细菌? silicate bacteria;silicate dissolving bacteria 能分解硅铝酸盐类矿物,释放钾素营养的细菌。 注:目前用于生产菌种的主要是胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)和土壤芽孢杆菌(Bacillus edaphicus)。 3.12.4?溶磷微生物? phosphate solubilizing microorganism 能分解有机磷化合物或溶解无机磷化合物的微生物总称。 3.12.5?光合细菌? photosynthetic bacteria 能利用光能进行细胞代谢活动的细菌。 3.12.6?菌根真菌? mycorrhizal fungi 能与植物根系共生形成菌根的线?丛枝菌根真菌? arbuscular mycorrhizal fungi 能与植物根系形成丛枝菌根的线?植物促生根圈微生物? plant growth-promoting rhizosphere microorganism 存在于植物根圈的一类能够产生植物生长物质,或是通过对有害微生物的抑制促进植物生长的微生物的总称。包括植物促生根圈细菌(plant growth-promoting rhizobacterium,PGPR)和植物促生根圈真菌(plant growth-promoting rhizosphere fungus ,PGPF)。 4培养基 4.1?培养基? medium;culture medium 由人工配制的适合微生物生长、代谢、繁殖和保存的营养基质。 4.2?种子培养基? seed medium 为获得微生物接种物(6.2)而制备的培养基(4.1)。 4.3?发酵培养基? fermentation medium 为获得微生物发酵终产物(菌体和代谢产物)而制备的培养基(4.1)。 4.4?天然培养基? natural medium 用动植物组织或微生物细胞及其提取物、粗消化产物制成的培养基(4.1),其营养丰富但不知确切成分。 4.5?合成培养基? defined medium 由成分和含量都已知的化学试剂配制成的培养基(4.1)。 4.6?半合成培养基? semi-defined medium 既含有天然成分又含有化学试剂的培养基(4.1)。 4.7?选择培养基? selected medium 根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的特性而设计的培养基(4.1),其功能是使混合菌群中的某一种菌成为优势菌群。 4.8?鉴别培养基? differential medium 加有抑制剂或指示剂等用于区分不同微生物种类的培养基(4.1)。 5灭菌 5.1?灭菌? sterilization 应用物理或化学方法杀灭或清除一切微生物的措施。 5.2?高压蒸汽灭菌法? high-pressure steam sterilization 利用高压蒸汽进行灭菌的方法。 5.3?间歇灭菌法? fractional sterilization 指间歇一定时间,采用常压蒸汽连续多次进行灭菌的方法。 5.4?干热灭菌法? dry heat sterilization 利用加热的高温空气进行灭菌的方法。 5.5?火焰灭菌法? flame sterilization 通过火焰高温灼烧进行灭菌的方法。 5.6? 电离辐射灭菌法? ionizing radiation sterilization 利用放射性同位素(如60Co或137CS)产生的γ射线?微波灭菌法? microwave sterilization 利用电磁波进行灭菌的方法。 5.8?紫外线灭菌法? ultraviolet light sterilization 利用紫外线照射进行灭菌的方法。 5.9?过滤除菌法? filtration sterilization 用机械阻留技术(如过滤、吸附)除去介质中微生物的方法。 5.10?化学灭菌法? chemical sterilization 利用化学药剂进行灭菌的方法。 6生产 6.1?接种? inoculation 按无菌操作技术要求将目的微生物移接到培养基质中的过程。 6.2?接种物? inoculum 种子 微生物工业化生产中,用于开始一个新培养的微生物培养物(6.5)。 6.3?接种量? inoculum dose 接种物(6.2)的量(体积或质量)与发酵物的量(体积或质量)之比。 6.4?培养? cultivation 在适宜条件下,使目的微生物生长繁殖和产生代谢产物的方法和技术。 6.5?培养物? culture 经接种(6.1)和培养(6.4)之后,在培养基(4.1)中形成的特定类型微生物的生长物。 6.6?纯培养? pure culture 只让一种微生物生长繁殖的培养(6.4)过程。 6.7?种子扩大培养? inoculum enlargement 将生产菌种经过一系列的步骤逐级扩大培养,获得一定数量和质量的培养物(6.5)的技术和过程。 6.8?发酵? fermentation 采用工业化生产方式培养微生物,获得终产物(菌体和代谢产物)的过程。 6.9?载体? carrier 用于吸附目的微生物,并且适宜其存活,对人、动植物和环境安全的固体物料。 6.10?浓缩? condensation 采用某种技术或方法减少发酵液水分,提高目的微生物的数量和代谢产物含量的过程。 6.11?吸附? adsorption 将发酵液与载体(6.9)混合,使目的微生物附着在载体上的过程。 6.12?造粒? granulation 将微生物肥料(2.1)制成颗粒剂型的过程。 7质量检验 7.1?外观? appearance 样品的外部形态。 7.2?含水量? moisture percentage 样品在105℃烘烤4h-6h所失去的质量,以质量百分数计。 7.3?细度? particle size 样品通过规定标准试验筛的质量百分数。 7.4?有机质含量? content of organic matter 以容量法测定的样品中有机物质的量,以质量百分数计。 注:容量法可参考NY 525-2002《有机肥料》。 7.5?总养分? total primary nutrient 总氮、有效五氧化二磷和氧化钾含量之和,以质量百分数计。 [GB 15063-2001,定义3.8] 7.6?有效菌? functional microorganism;effective microorganism 样品中的目的微生物群体。 7.7?有效[活]菌数? number of functional microorganism 每克或每毫升样品中有效菌(7.6)的数量。 7.8?杂菌? contaminating microorganism 样品中有效菌(7.6)以外的其它菌。 7.9?杂菌数? number of contaminating microorganism 每克或每毫升样品中杂菌(7.8)的数量。 7.10?杂菌率? percentage of contaminating microorganism 样品中杂菌数(7.9)占有效菌数(7.7)与杂菌数(7.9)之和的百分数。 7.11?粪大肠菌群? fecal coliforms 一群在44.5℃±0.5℃条件下,能发酵乳糖、产酸产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌的总称。 [GB/T 19524.1—2004,定义2] 7.12?粪大肠菌群数? number of fecal coliforms 每克或每毫升样品中粪大肠菌群(7.11)的最大可能数(?MPN?)。 [GB/T 19524.1—2004,定义2] 7.13?蛔虫卵死亡率? mortality of ascarid egg 样品中死亡蛔虫卵数占总蛔虫卵数的百分数。 7.14?重金属含量? content of heavy metal 样品中含有的砷(As)、铅(Pb)、镉(Cd)、铬(Cr)、汞(Hg)化合物的总量。 7.15?保质期? shelf-life 在标签标识注明的贮存条件下,保持微生物肥料质量的期限。 7.16?微生物肥料效应? microbial fertilizer effect ??? 微生物肥料对作物产量、品质、抗病(虫)害和抗逆能力,以及对土壤肥力的效果。 农用微生物菌剂国家标准(GB 20287-2006) 前??? 言 本标准的5.1、5.3和第8章条文为强制性条款,其余为推荐性条款。 本标准的附录A、附录C和附录D为规范性附录,附录B为资料性附录。 农用微生物菌剂 1范围 本标准规定了农用微生物菌剂(即微生物接种剂)的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则、包装、标识、运输和贮存。 本标准适用于农用微生物菌剂类产品。 2规范性引用文件(略) 3术语和定义(略) 4产品分类 产品按剂型可分为液体、粉剂、颗粒型;按内含的微生物种类或功能特性可分为根瘤菌菌剂、固氮菌菌剂、解磷类微生物菌剂、硅酸盐微生物菌剂、光合细菌菌剂、有机物料腐熟剂、促生菌剂、菌根菌剂、生物修复菌剂等。 5要求 5.1菌种 ??? 生产用的微生物菌种应安全、有效。生产者应提供菌种的分类鉴定报告,包括属及种的学名、形态、生理生化特性及鉴定依据等完整资料。生产者应提供菌种安全性评价资料。采用生物工程菌,应具有允许大面积释放的生物安全性有关批文。 5.2产品外观(略) 5.3产品技术指标 5.3.1农用微生物菌剂产品的技术指标见表1,其中有机物料腐熟剂产品的技术指标按表2执行。 ?表1? 农用微生物菌剂产品的技术指标 项?? 目 剂? 型 液 体 粉 剂 颗 粒 有效活菌数(cfu)a ?,亿/g(mL) ≥ 2.0 2.0 1.0 霉菌杂菌数,个/g(mL) ≤ 3.0×106 3.0×106 3.0×106 杂菌率, % ≤ 10.0 20.0 30.0 水分,% ≤ - 35.0 20.0 细度,% ≥ - 80 80 pH值 ? 5.0~8.0 5.5~8.5 5.5~8.5 保质期b,月 ≥ 3 6 a 复合菌剂,每一种有效菌的数量不得少于0.01亿/g(mL);以单一的胶质芽胞杆菌(Bacillus mucilaginosus)制成的粉剂产品中有效活菌数不少于1.2亿/g。 b 此项仅在监督部门或仲裁双方认为有必要时检测。 ? 表2? 有机物料腐熟剂产品的技术指标 项目 剂?? 型 液 体 粉 剂 颗 粒 有效活菌数(cfu), 亿/g(mL) ≥ 1.0 0.50 0.50 纤维素酶活a,U/g(mL) ≥ 30.0 30.0 30.0 蛋白酶活b,U/g(mL) ≥ 15.0 15.0 15.0 水 分,% ≤ - 35.0 20.0 细 度,% ≥ - 70 70 pH值 ? 5.0~8.5 5.5~8.5 5.5~8.5 保质期c,月 ≥ 3 6 a 以农作物秸秆类为腐熟对象测定纤维素酶活。 b 以畜禽粪便类为腐熟对象测定蛋白酶活。 c 此项仅在监督部门或仲裁双方认为有必要时检测。 ? 5.3.2农用微生物菌剂产品中无害化指标见表3。 表3? 农用微生物菌剂产品的无害化技术指标 参数 ? 标准极限 粪大肠菌群数,个/g(mL) ≤ 100 蛔虫卵死亡率,% ≥ 95 砷及其化合物(以As计),mg/kg ≤ 75 镉及其化合物(以Cd计),mg/kg ≤ 10 铅及其化合物(以Pb计),mg/kg ≤ 100 铬及其化合物(以Cr计),mg/kg ≤ 150 汞及其化合物(以Hg计),mg/kg ≤ 5 ? 6试验方法 6.1仪器设备(略) 6.2试剂(略) 6.3产品参数的检测 6.3.1外观(感官)的测定 取少量样品放到白色搪瓷盘(或白色塑料调色板)中,仔细观察样品的颜色、形状、质地。 6.3.2有效活菌数的测定 采用平板计数法,根据所测微生物的种类选用适宜的培养基。 若采用最大可能数(Most Probable Number,MPN)5管法,遵照附录C的规定。 系列稀释 称取样品10 g(精确到0.01 g),加入带玻璃珠的100 mL的无菌水中(液体菌剂取l0.0 mL加入90 mL的无菌水中),静置20 min,在旋转式摇床上200 r/min充分振荡30 min,即成母液菌悬液(基础液)。 用无菌移液管分别吸取5.0mL上述母液菌悬液加入45 mL无菌水中,按1:10进行系列稀释,分别得到1:1×101,1:1×102,1:1×103,1:1×104……稀释的菌悬液(每个稀释度应更换无菌移液管)。 加样及培养 每个样品取3个连续适宜的稀释度,用无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1 mL,加至预先制备好的固体培养基平板上,分别用无菌玻璃刮刀将不同稀释度的菌悬液均匀地涂于琼脂表面。 每一稀释度重复3次,同时以无菌水作空白对照,于适宜的条件下培养。 菌落识别 根据所检测菌种的技术资料,每个稀释度取不同类型的代表菌落通过涂片、染色、镜检等技术手段确认有效菌。当空白对照培养皿出现菌落数时,检测结果无效,应重做。 菌落计数 以出现20~300个菌落数的稀释度的平板为计数标准(丝状线个菌落数),分别统计有效活菌数目和杂菌数目。当只有一个稀释度,其平均菌落数在20~300个之间时,则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度,其平均菌落数均在20~300个之间时,应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数;若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。有效活菌数按式(1)或式(2)计算: ? ???????????nm =?? Xkv1/(m0v2) ×10-8?…………………(1) nv =?? Xkv1/(v0v2) ×10-8 ?…………………(2) 式中: nm — 质量有效活菌数,???????? 亿/g ????????? nv — 体积有效活菌数,???????? 亿/mL ????????? X— 菌落平均数,??????????? ?个 k — 稀释倍数 v1 — 基础液体积,???????????? mL v2 — 菌悬液加入量,?????????? mL v0 — 样品量,???????????????? mL m0 — 样品量,???????????????? g 6.3.3霉菌杂菌数的测定 采用马丁培养基,测定方法同6.3.2。 6.3.4杂菌率的测定 除样品有效菌外其它的菌均为杂菌。样品中杂菌率按式(3)计算: ????????????? m = n1/(n1+n)×100?…………………(3) 式中: m — 样品杂菌率,???????????? % ??????????? n1 — 杂菌数,??????????????? 亿/g(mL) ??????????? n — 有效活菌数,??????????? 亿/g(mL) 6.3.5水分的测定 将空铝盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃烘干 0.5 h,冷却后称量记录空铝盒的质量。然后称取2份平行样品(颗粒型样品,应先粉碎过1.0 mm试验筛),每份20 g(精确到0.01 g),分别加入铝盒中并记录质量。将装好样品的铝盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃下烘干4 h~6 h。取出置于干燥器中冷却20 min后进行称量。水分含量按式(4)计算(结果为两次测定的平均值): ???????? w = (m1- m2)/( m1- m0) ×100???…………………(4) 式中: w — 样品水分含量,?????????? % m0 — 空铝盒的质量,?????????? g m1 — 样品和铝盒的质量,?????? g m2 — 烘干后样品和铝盒的质量, g 6.3.6细度的测定 粉剂样品 称取样品50 g(精确到0.1 g),放入300 mL烧杯中,加200 mL水浸泡10 min~30 min后倒入孔径0.18 mm的试验筛中,然后用水冲洗,并用刷子轻轻地刷筛面上的样品,直至筛下流出清水为止。将试验筛连同筛上样品放入干燥箱中,在105 ℃±2 ℃烘干4 h ~6 h。冷却后称量筛上样品质量。样品细度按式(5)计算: s ?={1- m1/[ m0(1-w)]} ×100??…………………(5) 式中: s ?— 筛下样品质量分数,???? % m0 ?— 样品质量,???????? ????g w ??— 样品含水量,?????????? % m1 ?— 筛上干样品质量,??? ???g 颗粒样品 称取样品50 g(精确到0.1 g),将两个不同孔径的试验筛(1.0 mm和4.75 mm)摞在一起放在底盘上(大孔径试验筛放在上面)。样品倒入大孔径试验筛内筛样品,然后称小孔径试验筛上的样品质量。颗粒细度按式(6)计算: ???????? g = m1 /m0 ×100 ???…………………(6) 式中: g — 样品质量分数, ?????????% m1 — 小孔径试验筛上样品质量,g m0 — 样 品 质 量,?????? ????g 6.3.7pH值的测定 打开酸度计电源预热30 min,用标准溶液校准。 pH值的测定,每个样品重复三次,计算三次的平均值。 液体样品 用量筒取40mL样品放入50 mL的烧杯中,直接用酸度计测定,仪器读数稳定后记录。 粉剂样品 称取样品15 g,放入50 mL的烧杯中,按1:2(样品:无离子水)的比例将无离子水加到烧杯中(如果样品含水量低,可根据基质类型按1:3~1:5的比例加无离子水),搅拌均匀。然后静置30 min,测样品悬液的pH值,仪器读数稳定后记录。 颗粒样品 样品先研碎过1.0 mm试验筛,按照的方法测定。 6.3.8粪大肠菌群数的测定 应符合GB/T 19524.1《肥料中粪大肠菌群的测定》的规定。 6.3.9蛔虫卵死亡率的测定 应符合GB/T 19524.2《肥料中蛔虫卵死亡率的测定》的规定。 6.3.10纤维素酶活、蛋白酶活的测定 应符合附录D的规定。 6.3.11砷、镉、铅、铬、汞的测定 应符合GB 18877—2002中的5.12~5.17的规定。 6.3.12保质期的检验 在产品说明书标明的保质期前,按6.3.1~6.3.11方法测定产品相应指标。 7检验规则 本标准中产品技术指标的数字修约应符合GB 8170的规定;产品质量合格判定应符合GB 1250中修约值比较法的规定。 ? 7.1抽样 按每一发酵罐菌液(或每批固体发酵)加工成的产品为一批,进行抽样检验,抽样过程严格避免杂菌污染。 7.1.1抽样工具 无菌塑料袋(瓶),金属勺、抽样器、量筒、牛皮纸袋、胶水、抽样封条及抽样单等。 7.1.2抽样方法和数量 一般在成品库中抽样,采用随机法抽取。 抽样以件为单位,小包装以每一包装箱为一件。随机抽取3~5件,每件中随机抽取一袋(瓶);若每袋(瓶)包装小于500 g(mL)的产品,应多抽几件。大包装产品以一袋(桶)为一件,随机抽取5~10件,在无菌条件下,每件取样500 g(mL),然后将抽取样品混匀,按四分法分装3袋(瓶),每袋(瓶)不少于500 g(mL)。 7.2检验分类(略) 7.3判定规则 7.3.1具下列任何一条款者,均为合格产品 a. 检验结果各项技术指标均符合标准要求的产品; b. 在产品的外观、水分、细度、pH值等检测项目中,有1项不符合要求,而其它各项技术指标符合要求的产品。 7.3.2具下列任何一条款者,均为不合格产品 a. 有效活菌数不符合技术指标; b. 霉菌杂菌数不符合技术指标; c. 杂菌率不符合技术指标; d. 粪大肠菌群不符合技术指标; e.???? 蛔虫卵死亡率不符合技术指标; f. 砷、镉、铅、铬、汞中任一含量不符合技术指标; g. 有机物料腐熟剂产品中所测酶活不符合技术指标; h. 在外观、水分、细度、pH值等检测项目中,有2项(含)以上不符合要求。 8包装、标识、运输和贮存 ??? 参见NY 885-2004《农用微生物产品标识要求》 附录A?? 常用检测培养基 参见NY/T 1114-2004《微生物肥料实验用培养基技术条件》 附录B(资料性附录) 常用染色剂 B.1革兰氏染色剂 B.1.1结晶紫染色液(Hucker氏配方) 甲液:结晶紫(Crystal violet)?????? 2.0 g ????? 乙醇(95%)??? ??????????????????20.0 mL 乙液:草酸铵[(NH4)2C2O4?H2O]? ???????????0.8g ????? 蒸馏水? ???????????????????????80.0 mL 甲、乙两液相混,过滤,棕色瓶保存。 B.1.2卢哥(Lugol)氏碘液 碘(I2)片??? ????????????????????????1.0 g 碘化钾(KI)??? ??????????????????????2.0 g 蒸馏水? ????????????????????????????300 mL 先溶碘化钾于少量蒸馏水中,再将碘溶于碘化钾溶液中,可稍加热,最后加足蒸馏水,棕色瓶保存。 B.1.3脱色液? 95%的乙醇液。 B.1.4复染液? 0.5%的番红水溶液(Safranin O) 2.5%的番红酒精溶液?? ???????????????20 mL 蒸馏水? ????????????????????????????80 mL B.2芽胞染色液 B.2.1孔雀绿染色液(Malachite green) 孔雀绿? ???????????????????????????5.0 g 蒸馏水? ??????????????????????????100 mL B.2.20.5%番红染色液 B.3石碳酸复红染色液 甲液:碱性复红(Basic fuchsin)? ???0.3 g ????? ?95%酒精? ???????????????????10.0 mL 乙液:石碳酸(Phenoecrystals C.P) ?5.0 g ????? ?蒸馏水?????????????? ???????95 mL 将甲、乙两液混合后即得石碳酸复红染色液原液。染色时,将原液稀释5~10倍使用。 附录C(规范性附录) 稀释法(MPN 5管法) C.1稀释 称取样品10.0 g,加入带玻璃珠的100 mL的无菌水中(液体菌剂取l0.0 mL加入90 mL的无菌水中),静置20 min,在旋转式摇床上200 r/min充分振荡30 min,即得到1×101稀释度的菌悬液。 用无菌移液管吸取5.0mL上述菌悬液加入到装有45mL无菌水的三角瓶中,充分振荡摇匀,得到1×102稀释度的菌悬液,依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀释度的菌悬液(每个稀释度应更换无菌移液管)。 C.2加样 选择适宜的5个连续稀释度,用无菌移液管分别吸取不同稀释度的菌悬液1.0 mL,加到已准备好的盛有9.0 mL无菌培养基的螺口试管中,每一稀释度重复接5支试管(不同稀释度间更换无菌移液管),同时用无菌培养液作对照。 C.3培养 接种后立即拧紧塑料帽并摇匀,将接种好的试管放到适宜的条件下培养。 C.4计算 根据各稀释系列试管中有无待测微生物生长或其生理反应的正或负得出数量指标,并在相应的MPN统计表中查出近似值(见表C1),即可计算出待测样品的有效活菌数,以亿个/mL或亿个/g表示。 计算方法: 1mL(g)样品中的有效活菌数=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释倍数 C.5计数规则 在稀释系列中必须最后一个稀释度所有重复间都没有微生物生长。确定数量指标系取稀释系列中所有重复都有生长(或是正反应)的最高稀释度为数量指标的第一位数字,总共取三个连续稀释管的结果查表。 C.5.1在全部5支试管中均出现生长的稀释度中,把出现生长的稀释度倍数最高的那一级放入数列。例如:为5-5-3-0-0时,则取5-3-0数列; C.5.2在全部5支试管中均不出现生长的稀释度中,把稀释度倍数最低的那一级放入数列。例如:为5-3-0-0-0时,则取5-3-0数列; C.5.3如果应用上述两条规则,会出现采用如5-5-4-3-0这样的4个等级的稀释度的情况。此时,可先取前面的5-4-3数列,后取4-3-0数列,分别求出lgMPN,然后算出其真数的平均值。在此列中,数列5-4-3的lgMPN为1.447,数列4-3-0的lgMPN为0.431+1(后一数列与前一数列相应稀释了10倍,故要加1进行校正),(1.447+1.431)/2=1.439,所以MPN=27.5。 表C.1? MPN,lgMPN表 阳性试管数 MPN (相当于第一稀释管1毫升) ? LgMPN 阳性试管数 MPN (相当于第一稀释管1毫升) ? LgMPN 第一 稀释管 第二 稀释管 第三 稀释管 第一 稀释管 第二 稀释管 第三 稀释管 0 0 0 0 - 5 0 0 2.3 0.362 0 1 0 0.18 0.255-1 5 0 1 3.1 0.491 1 0 0 0.20 0.301-1 5 1 0 3.3 0.519 1 1 0 0.40 0.602-1 5 1 1 4.6 0.663 2 0 0 0.45 0.653-1 5 2 0 4.9 0.690 2 0 1 0.68 0.833-1 5 2 1 7.0 0.845 2 1 0 0.68 0.833-1 5 2 2 9.5 0.978 2 2 0 0.93 0.968-1 5 3 0 7.9 0.898 3 0 0 0.78 0.892-1 5 3 1 11.0 1.041 3 0 1 1.1 0.041 5 3 2 14.0 1.146 3 1 0 1.1 0.041 5 4 0 13.0 1.114 3 2 0 1.4 0.146 5 4 1 17.0 1.230 4 0 0 1.3 0.114 5 4 2 22.0 1.342 4 0 1 1.7 0.230 5 4 3 28.0 1.447 4 1 0 1.7 0.230 5 5 0 24.0 1.380 4 1 1 2.1 0.322 5 5 1 35.0 1.544 4 2 0 2.2 0.342 5 5 2 54.0 1.732 4 2 1 2.6 0.415 5 5 3 92.0 1.964 4 3 0 2.7 0.431 5 5 4 160.0 2.204 ? ? ? ? ? 5 5 5 180.0 2.255 ?附录D (略)????????????????????? 农业专用微生物菌剂:/a/chanpinzhongxin/???????? 微生物肥料实验用培养基技术条件(NY/T 1114-2006) 1范围 本标准规定了微生物肥料实验室使用的培养基技术要求。 本标准适用于微生物肥料产品质量检验、菌种培养与保藏用培养基的制备。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。 GB/T 19524.1-2004 ? 肥料中粪大肠菌群的测定 NY 527-2002???????? 光合细菌菌剂 3术语和定义 培养基 medium 由人工配制的适合微生物生长、代谢、繁殖和保存的营养基质。 4培养基制备流程图(略) 5培养基选用原则 5.1含有满足所培养的微生物生长必需的营养物质。 5.2各种营养物质要有合适的比例和浓度。 5.3有合适的pH范围和一定的缓冲pH能力。 5.4有一定的氧化还原电位和合适的渗透压。 5.5对于特殊用途的培养基,除遵循以上原则外,还应满足以下要求: 5.5.1在选择培养基中,应加入利于目的微生物生长而抑制其它微生物生长的化学物质。 5.5.2菌种保藏培养基选用原则 对于产芽孢或孢子的菌种保藏培养基应以易产生芽孢或孢子为原则。 对于自养微生物的菌种保藏培养基应只使用无机盐类,不使用有机物。 对能利用无机氮源的微生物,其菌种保藏培养基中不宜使用有机氮源。 对营养缺陷型微生物,其菌种保藏培养基中必须含有该缺陷所需的物质。 对耐某种药物的微生物,其菌种保藏培养基中应含有一定浓度的该种药物。 6要求 6.1材料 6.1.1用于配制培养基的化学试剂纯度至少为化学纯。 6.1.2试剂出现颜色改变、沉淀、混浊、吸潮结块的现象时,不宜使用。 6.1.3天然原材料应质量稳定,未发生霉变、生虫和变质。 6.1.4琼脂凝固后应具有良好的透明度。 6.2器皿 6.2.1配制试剂所用的器皿应洁净。 6.2.2盛装培养基的器皿应由对微生物无毒害并耐高温的材料制成。 6.2.3材料需加热溶解时,可选用玻璃容器、搪瓷缸和不锈钢容器等,禁用铜制、铝制和铁制容器。 6.3棉塞或硅胶塞 6.3.1不应使用脱脂棉制作棉塞。 6.3.2使用棉塞或硅胶塞时,将其长度的2/3塞入容器内。要求松紧适当,紧贴管壁。 6.3.3灭菌时,棉塞外要加包牛皮纸或耐高温透气塑料薄膜,以防止灭菌时棉塞受潮或进水。 6.4培养基配制 6.4.1材料称量 根据培养基配方,准确称取相应材料的量。 当配方中某种成分微量时,可预先将该成分配制成一定浓度的母液,然后按量加入。母液须低温保存。 6.4.2材料溶解 不溶于水的组分应在所需的溶剂中溶解后,再加入到培养基中。 非溶性组分,如CaCO3,应最后加入。 易形成沉淀的组分应分别溶解。 不易溶解的组分应做预处理。加热溶解过程中一旦出现焦化现象时应弃用。 培养基中含有指示剂或有颜色的试剂时,应在培养基pH调节好之后再加入。 6.4.3pH测定与调节 用精密pH试纸或酸度计测定培养基的pH。 培养基的pH用稀酸或稀碱溶液调节。调节过程中不可用酸碱溶液反复调节。 6.4.4分装 装入三角瓶的培养基体积不应超过其容量的1/2,装入试管的培养基体积为其容量的1/4~1/5。分装过程中防止培养基粘附在瓶口或管口。 6.4.5灭菌 高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌控制的条件为121℃、维持30min。当培养基中含有不耐高温的组分时,可采用115℃、维持15min~30min。 过滤除菌 在无菌条件下,将待除菌溶液经滤膜为φ≦0.2μm的细菌过滤器,达到除菌的目的。适用于易受高温破坏、失活的物质的灭菌,如维生素。 干热灭菌 将待灭菌的器皿,用纸包好或放在特定的容器内,置于烘箱中,在160℃左右保持2h。适用于培养皿等玻璃器皿的灭菌。 6.4.6平板和斜面的制备 在无菌条件下把冷却至45℃左右的培养基倒入无菌培养皿内,平板厚度范围控制在3mm~5mm。制备的斜面长度不超过试管长度的2/5。 6.5培养基合格检验 6.5.1检查固体培养基湿度。培养基冷凝水过多或干燥出现裂痕时,均不能使用。 6.5.2随机抽取已灭过菌的培养基放入28℃~30℃培养箱中培养24h~48h,确定无菌生长后方可使用。 6.6培养基存放 培养基应放在冰箱4℃~8℃保存。经过存放的培养基使用前应进行6.5的合格检验,合格后方可使用。 7微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途 微生物肥料常用培养基配方、配制要点和用途参见附录A。

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